改良银染法在病理诊断中的应用

　　作者：王雷明，钟延丰（北京大学医学部病理学系）于文娟（青医院病理科）

　　来源：诊断病理学杂志

　　银染法作为传统的特殊染色方法仍然是显示病原体、组织及细胞内特殊结构的简便而可靠的方法之一，其原理是利用生物组织成分对银离子还原性质的不同，显示组织及其中微生物的形态。我们通过应用改良银染法对组织进行染色，取得良好效果，总结如下。

　　1、材料与方法

　　1.1材料

　　银染试剂盒（改良银染法），北京世济合力生物科技有限公司提供。

　　1.2方法

　　1.2.1实验前准备 　　取15ml溶剂加入浸银粉缸，将脱蜡到水的石蜡切片（或固定后的细胞涂片、冷冻切片）用蒸馏水洗后放入缸中；再分别取5ml、10ml溶剂加入显影粉瓶1、2中。将以上浸银液及显影液共同置于60℃温箱中助溶、浸银（＞30min），完全溶解后取出备用。

　　1.2.2实验步骤 　　将浸银液缸内的液体全部倒掉，蒸馏水洗2次（室温下避光）；将显影液1倒入显影液2中，快速摇匀后置入浸银液缸，显影3min（以组织呈现咖啡色为宜）；倒掉浸银液缸中的液体，流水洗2次；脱水、透明、封固。

　　2、改良银染法的应用

　　2.1检测微生物

　　2.1.1螺旋体 　　螺旋体是一群细长、柔韧、弯曲呈螺旋状的原核细胞微生物，其特性介于细菌与原虫之间。由于螺旋体折光性低，与透明液体相似，故用一般染料不易着色，须用银染色在高倍显微镜下才能查见，显色为棕黑色。螺旋体染色的机制被认为是螺旋体表面含有黏多糖和蛋白，在一定温度下能吸附硝酸银中的银离子，再经过显色剂作用使银离子还原为金属银，而使梅毒螺旋体染色为棕黑色［1］。目前银染法仍然是显示螺旋体的最佳组织学特染方法。

　　2.1.2幽门螺杆菌（HP） 　　HP具有嗜银性，其鞭毛的顶端可见一球状物，为鞘的延伸物，每一鞭毛根部均可见一个圆球状根基伸入菌体顶端细胞壁内侧，在其内侧尚有一电子密度降低区域，此区域与银离子有很强的结合能力。在一定条件下，HP可以从银液中吸附银离子，后经孵育液中的显色剂处理，银离子被还原为黑色的金属银而显色。银染法能直观地对HP感染进行诊断，敏感性和特异性、准确性均较高［2－4］，并可以半定量检测HP。半定量标准：胃黏膜表面及小凹内偶见待检细菌为（+）；可见散在的待检细菌，未聚集成簇为（++）；可见大量待检细菌，聚集成簇或片为（+++）（图1）。

　　2.1.3巴通菌 　　猫抓病（CSD）是世界性广泛分布的动物源性传染病，主要由猫传播，其病原为一种革兰氏染色阴性、银染色阳性的巴通菌（Bh）。但长期以来用各种细菌染色方法在病变淋巴结中均检测不到巴通菌，细菌培养亦阴性（该菌不易在常用培养基中生长）。Wear［5］在1例曾被猫抓伤的女孩的淋巴结中用银染色首次发现嗜银杆菌。染色原理是Bh菌呈现多形性，一端粗大如棒状，常呈链状排列，有分支及分隔，可构成网状，银颗粒可附着于其膜外，使杆菌外形变粗大易于观察。在受累淋巴结内，特别在坏死区，用银染法可找见灶性分布的巴通菌体，这对诊断非常重要。

　　2.1.4放线菌 　　放线菌是革兰氏阳性丝状杆菌，是引起放线菌病的病原菌，亦引起慢性化脓性肉芽肿性病变，可发生于任何部位，主要侵犯颌颈部和胸腹部。徐炜［6］用银染法在镜下观察到放线菌菌落及菌丝呈黑色，菌丝呈杆状分支，组织背景呈黄棕色，对比鲜明，易于辨认，且操作方便。

　　图1胃黏膜内可见簇状或片状的幽门螺杆菌改良银染法

　　图2显示纤维化肉芽肿内的尘细胞改良银染法

　　图3显示黑色素颗粒改良银染法

　　2.2检测异物

　　矽结节是矽肺患者肺部病变的主要表现，早期诊断较困难。Liu［7］曾用银染法显示吞噬细胞内的尘粒，使矽结节呈黑色，具有一定的形态学特征（图2）。实验研究发现，矽尘颗粒外周均有一层膜壳状结构，推测其形成可能与颗粒被吞入细胞后表面附着的生物膜蛋白有关［8］，此蛋白与银颗粒的结合被认为是显示尘粒的机制，而且染色的机制与尘粒的元素成分无关。银染法与HE染色切片形成鲜明对比，并显示了其优越性。

　　2.3显示机体组织、细胞

　　2.3.1黑色素颗粒 　　银染色不显示FM染色法中常被着色的甲醛、铁、脂褐素和其他嗜银颗粒，从而能更清楚且较特异地显示出黑色素颗粒（图3），当银染色阳性时即可确认为恶性黑色素瘤［9］，银染色可以作为恶性黑色素瘤病理诊断的一个重要辅助方法。

　　2.3.2神经纤维及髓鞘 　　目前常用镀银法显示神经纤维，如Bielschowsky法、Roger法和RamonyCajal法等，各方法的基本点都是把固定后的标本或切片浸泡于硝酸银溶液中，再用还原剂处理，使银颗粒沉着于轴索的轴浆中呈黑色或深棕色。这些方法步骤繁琐，费时费力，并需贵重金属调色，有时染色并不理想。刘红刚等［10］对经过固定后的冷冻切片直接进行银染，快速、便捷，并能清晰地显示神经组织内的神经纤维及其髓鞘，对髓鞘病变及神经病变的诊断具有重要作用。但研究发现石蜡切片染色时，胶原纤维等成分也可着色，背景干扰大，此为不足之处。

　　2.3.3甲状腺滤泡旁细胞 　　显示甲状腺滤泡旁细胞（C细胞）常用的方法有组织块整染法和切片镀银改进法［11］，但在制作过程中存在着结果不稳定、方法不易掌握等不足。应用改良银染法也可以直接对甲状腺组织石蜡切片染色并能显示出甲状腺滤泡旁细胞。对于甲状腺髓样癌及C细胞腺瘤的C细胞均可显示，但有时也将甲状腺滤泡上皮细胞染成黑色，此时需注意判断。

　　2.3.4小胶质细胞和少突胶质细胞 　　小胶质细胞和少突胶质细胞具有较丰富的细胞色素氧化酶和琥珀酸脱氢酶，并含有纤维黏连蛋白和层黏连蛋白，对银离子有吸附作用，使其沉积在胶质细胞，使细胞形态显示出来［12］。在脑组织切片中，小胶质细胞和少突胶质细胞核染成黑色，神经细胞染成棕黄色，从而对肿瘤的诊断有很大的帮助。但在反应时间上应注意把握，时间过长会导致背景颜色加深，影响判断。

　　3、讨论

　　3.1与普通Warthin-Starry方法不同之处

　　①Warthin-Starry法为醋酸盐缓冲液，其改良法为柠檬酸盐缓冲液。

　　②试剂盒有包装，操作简化，效率提高；立式塑料染缸可成批或单样本染色，减少样本间的污染。

　　③切片银污染程度较小，观察对比清晰。

　　3.2注意事项

　　①实验前准备及实验过程中避免阳光直射。

　　②实验前准备阶段各试剂要充分溶解，各显影液充分混匀。

　　③显色过程中随时观察显色情况，避免时间过长或过短造成染色效果不佳。

　　④一次性染色过程，不能长时间放置；在某些组织细胞染色（如神经纤维染色）方面效果稍差。

　　由于银染法可显示螺旋体等多种病菌、黑色素颗粒及尘埃颗粒等细胞内颗粒物，说明它不具备一对一的特异性，但上述阳性物质各具形态特征及所在病变组织、细胞的背景，因此鉴别并不困难。改良银染法是一种较为经济实用的染色法，试剂配制操作简便，诊断准确迅速，在一般的实验室即能广泛开展；结合临床及组织学特点，银染法具有简便、快捷、可靠的优点，是其他方法所不能替代的。

　　参考文献：

　　［1］曾赛凡，张声。改良Warthin-Starry螺旋体染色在诊断神经系统梅毒中的应用［J］。福建医科大学学报，，（S1）：－.

　　［2］辛强。改良Warthin-Starry银染色法在幽门螺杆菌检测中的应用［J］。中国卫生检验杂志，，18（11）：.

　　［3］彭霞。改良W-S银染法在幽门螺杆菌染色中的应用［J］。贵阳中医学院学报，，30（3）：45.

　　［4］韩亚京。幽门螺杆菌银盐染色方法改进［J］。北京医科大学学报，，30（5）：.

　　［5］韦义萍，邓卓霖，陆海霞，等。猫抓伤与巴通菌感染［J］。广西医科大学学报，，25（3）：.

　　［6］徐炜。HE+PAS+改良Warthin-Starry染色技术联合诊断放线菌病［J］。临床与实验病理学杂志，，19（5）：－.

　　［7］LiuHG.Warthin-Starrysilvermethodshowingparticulatematterinmacrophage［J］。BiomedEnvironmSci，，21（1）：85－89.

　　［8］吕智春，岳常丽，刘红刚。矽结节银染色的形态学特点及其在矽肺组织病理学检查中的意义［J］。中华劳动卫生职业病杂志，，25（6）：－.

　　［9］岳常丽，刘红刚。结节病肉芽肿构成细胞内空气细颗粒物的观察［J］。临床与实验病理学杂志，，22（5）：.

　　［10］刘红刚，杨金辉，郑麟蕃，等。介绍一种新的神经纤维染色法［J］。现代口腔医学杂志，，8（3）：.

　　［11］赵荧，杨镇欧。显示甲状腺滤泡旁细胞镀银法［J］。北京大学学报（医学版），，（1）：50.

　　［12］马廷贤。显示小胶质细胞和少突胶质细胞镀银法的改良［J］。解剖学杂志，，23（3）：－.

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