粉防己碱分子包合物的制备及其吸入治疗肺纤

摘要：肺纤维化（PF）是一种间质性肺疾病，具有进行性和致命性呼吸困难的特征。粉防己碱（TET）是中草药StephaniatetrandraS.Moore的主要活性成分，该药物已在临床上用于治疗风湿病，肺癌和矽肺病。本研究开发粉防己碱-羟丙基-β-环糊精包合物（TET-HP-β-CD）用于吸入给药治疗肺纤维化。TET-HP-β-CD通过冷冻干燥法制备，并使用级联撞击器，差示扫描量热法（DSC），X射线衍射（XRD）和傅里叶变换红外光谱（FT-IR）进行鉴定。使用博来霉素诱导的肺纤维化大鼠模型评估吸入的TET和TET-HP-β-CD的作用，过程中检测动物存活率，肺中羟脯氨酸含量，并评估肺组织病理学。结果表明，吸入TET-HP-β-CD可减轻炎症和纤维化，限制肺中羟脯氨酸的积累，改善术后生存期。而且，与静脉给药相比，雾化递送TET-HP-β-CD后药物主要积累在肺部，并限制了其在全身分布。结果表明，TET-HP-β-CD喷雾剂是一种治疗肺纤维化的具有吸引力的候选药物。关键词：粉防己碱，肺纤维化，羟丙基-β-环糊精，包合物，肺递送1.简介肺纤维化（PF）是一种慢性致死性疾病，具有肺泡上皮细胞损伤和成纤维细胞增殖的特征，常导致正常肺组织的置换和肺弹性的破坏。肺组织结构的改变将导致严重的呼吸急促和不良预后，患者中位生存时间仅为2-3年。粉防己碱（TET，图1）是从一种名为粉防己的东方药用植物的根中提取的双苄基异喹啉生物碱。据报道，TET不仅可以有效防止成纤维细胞增殖和胶原合成，而且可以逆转纤维化。鉴于这些作用，TET已用于治疗心血管疾病，风湿病，关节痛，纤维化，矽肺病和肿瘤耐药性。此外，TET具有抗炎作用并可加速胶原蛋白的降解，它是天然产品，经济实惠，且与吡非尼酮相比，没有光毒性。遗憾的是，TET的水溶性低，导致生物利用度和功效差。此外，长期静脉给药后，由于广泛的药理作用和在肝脏中的蓄积，难以满足安全性和有效性的用药要求。Figure1.Molecularstructureoftetrandrine.雾化治疗是将药物非侵入性地递送至肺病变部位的有效方法，同时由于该部位较低浓度的代谢酶肺部递送也是一种将药物递送至全身的适当给药途径。基于以上所述，通过低全身暴露，低副作用和低频率给药的肺部递送有利于增强TET治疗肺纤维化的功效。环糊精（CDs）是一类由（α-1，4）连接的吡喃葡萄糖单元组成的环状寡糖，类似于带有内部疏水腔和亲水外部的空心截头圆锥体。这种微观结构使CD可以与亲脂性有机化合物形成非共价包合物，并改善其水溶性和稳定性。CD是一种无毒的赋形剂，口服，静脉和吸入给药耐受性良好。除了增加溶解度的作用外，（2-羟丙基）-环糊精（HP-CD）在环糊精家族中具有相对较高的药物溶解能力和更优良的毒理学性质，因此其在肺部输送系统中显示出巨大的潜力。本研究开发了可吸入的TET-HP-β-CD包合物，并评估了其在博来霉素诱导的肺纤维化大鼠模型中的治疗效果，研究了TET-HP-β-CD的理化性质，释放特征，肺部沉积特性和组织分布。2.材料与方法2.1材料TET原料购自金益柏生物技术有限公司（中国南京）。TET参考物质由国家食品药品监督管理局提供（中国北京）。HP-β-CD购自源叶生物技术有限公司（中国上海）。注射用盐酸博来霉素是由海正辉瑞制药有限公司（中国浙江）提供的。水由超纯水机设备。除非另有说明，所使用的其他试剂为分析纯试剂。2.2动物雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠重-g由实验动物中心（中国浙江省）提供，在25±1℃恒温条件下自由获取食物和水。实验方案经南京中医药大学动物保护和使用委员会批准。2.3相溶解度研究根据Higuchi和Connors报道的相溶度方法研究了HP-β-CD对TET的增溶效果。将过量的TET（mg）添加到20mL不同浓度HP-β-CD（0-14mmol-1）的蒸馏水中。将小瓶密封并在37℃下以rpm的速率在培养箱中振动48小时。达到平衡后，将悬浮液使用0.45μm的过滤器过滤。以nm为检测波长，使用HPLC测定TET的含量。在RP-C18色谱柱（4.6mm×mm，5μm，安捷伦科技有限公司，中国）体系中使用乙腈，0.3％三乙胺（83:17，v/v）的流动相以1.0mL/min的流速进行分析。所有样品均重复测试三次。根据以下方程式分析它们的相溶解度图，计算出表观稳定常数（Kc）。其中m是斜率，S0是没有HP-β-CD的情况下，TET在纯净水中的溶解度。2.4TET-HP-β-CD包合物的制备通过冷冻干燥法制备TET-HP-β-CD包合物。首先将TET溶于乙醇，然后将溶液以1：1的摩尔比缓慢滴加到HP-β-CD水溶液中。通过在60℃下连续搅拌6h获得混合溶液。反应完成后，将产物自然冷却至室温，并通过旋转蒸发除去乙醇，然后冷冻干燥24小时。通过冻干机（TelstarLyoQuest，TelstarTechnologiesS.L.U，西班牙）在室温下冷冻干燥悬浮液。最终，回收得到TET-HP-β-CD包合物。2.5TET-HP-β-CD包合物的鉴定使用X射线衍射仪（UltimaIV，Rigaku，Japan）分析了TET，HP-β-CD，干燥的包合物和两者物理混合物的晶体结构。将Cu-Kα靶X射线管参数设置为40kV和30mA，在5-50°的2θ范围内以5°/min的扫描速度来记录粉末的X射线衍射图。为了研究HP-β-CD与药物的宿主-客体相互作用，将样品与溴化钾（KBr）混合并研磨，压片。使用FT-IR光谱仪（Vertex80V，Bruker，德国）在-cm-1的范围内扫描样品的傅立叶变换红外光谱。借助差示扫描量热法（F3，Netzsch，德国）研究样品的热性质。在氮气吹扫下，对每个样品施加10℃/min的加热速率，检测范围为30-℃。2.6溶出度研究检测包合物的12小时释放特征，并与TET结晶粉末的释放特征进行比较。将样品（4mg）分别放入mL含0.5％Tween-80（v/v）的pH7.4磷酸盐缓冲盐水（PBS）的溶解杯中。通过桨叶旋转法以75±1rpm的速度进行测试，温度保持在37.5±0.1°C。通过2.3.5中所述的HPLC分析方法测定释放介质中的TET含量。2.7纳米悬浮液的制备和表征2.7.1纳米粒子的制备将包合物粉末（约含5mgTET）与生理盐水混合并搅拌。之后，使用实验室匀浆器（SPXFLOW，Inc.，USA）对混合的悬浮液进行高压均质。2.7.2纳米粒子尺寸分布和ζ电势的表征使用MalvernZetasizerNanoZS90（MalvernInstrumentsCo.，Ltd，UK）测定所得分散体的平均直径，尺寸分布和ζ电势。2.7.3透射电子显微镜（TEM）成像使用JEOLJEM-透射电子显微镜在80kV的电压下分析TET和TET-HP-β-CD纳米悬浮液的样品。2.7.4体外空气动力学评估根据美国药典（USP），使用空气压缩雾化器（M，Yuwell-JiangsuYuyueMedicalEquipment＆SupplyCo.，Ltd.）将纳米悬浮液雾化为气溶胶，以28.3L/min的气流通过安德森级联撞击器（ACI）（中国康华仪器制造厂）以此评估气溶胶的体外性能。使用甲醇水溶液冲洗0-7级的收集盘和微孔接触器（MOC）上的药物液，并通过上述HPLC方法测定TET含量。使用以下方程式计算发射剂量（ED），细颗粒分数（FPF），可呼吸分数（RF），质量中值空气动力学直径（MMAD）和几何标准偏差（GSD）。2.8吸入纳米悬浮液的血浆药代动力学和肺组织药物分布2.8.1气管内给药的药代动力学分析将12只体重为±20g的雄性SD大鼠随机分为两组，进行体内生物利用度研究。一组通过气管内给药递送TET纳米混悬剂（8mg/kg），另一组则给予TET-HP-β-CD包合物（剂量约5mg/kgTET）。简而言之，将大鼠用异氟烷麻醉，并通过其前门牙将其悬挂在倾斜工作台（北京慧荣和科技有限公司）上，如图7A所示。然后，在微型喉镜的观察下使用微型喷雾雾化器（北京慧荣和科技有限公司），将药物喷入大鼠的气道内。在指定时间（0.、0.25、0.5、0.75、0.75、1、1.5、2、4、6、8、12、24h）收集血样。通过在样品中添加乙腈脱蛋白并离心，然后通过UPLC/ESI-MS分析上清液。使用由含有0.1％甲酸（A）和乙腈（B）的流动相分离样品，流动相的梯度条件为0-0.3分钟，30％B；0.3-1分钟，30-60％B；1-3.5分钟，60％B；3.5-4分钟，60-30％B；4-5分钟，B浓度为30％，流速设定为0.30mL/min。通过DAS2.0软件计算药代动力学参数。2.8.2TET的肺和全身暴露量给大鼠施用剂量约为5mg/kg的TET（n=4）。简而言之，（Ⅰ）将TET纳米悬浮液雾化到大鼠呼吸道，（Ⅱ）将TET-HP-β-CD纳米悬浮液雾化输送到肺部，（Ⅲ）尾静脉注射盐酸粉防己碱注射液。在0.、1、3和12h的时间对大鼠（n=4）实施安乐死，收集肺组织并用生理盐水冲洗，然后加入超纯水（1mL/0.1g）后用组织匀浆器匀浆，最后对所得匀浆进行预处理并按照2.8节中的方法进行分析。2.9肺纤维动物模型和治疗在气管内滴注之前，将博来霉素（BLM）盐酸盐溶解在无菌生理盐水中（5mg/mL），以获得大鼠肺纤维化的模型。将大鼠随机分为五组：第Ⅰ组（对照组，n=12）在治疗过程中仅用雾化吸入生理盐水；第Ⅱ组（模型组，n=12）在第0天用BLM造模并雾化吸入生理盐水。第Ⅲ组（阳性组，n=12）在第0天用BLM造模并每周三次给予口服含0.5％（w/v）CMC-Na的TET悬浮液（50mg/kg），第Ⅳ组和Ⅴ组在第0天同样采用BLM造模（n=12），并通过气管内给予适当剂量的TET（5mg/kg）或TET-HP-β-CD（含5mg/kgTET）治疗，每周分别给药3次。在第7天和第14天，从每组中随机选择三只大鼠实施安乐死并收集血清和肺。4周后处死存活的大鼠，收集血清和肺，样品保存用于进一步分析。2.10TNF-α和羟脯氨酸测定将mg肺组织在1mLPBS（pH7.4）中匀浆，其中的肿瘤坏死因子-α（TNF-α）用市售的ELISA试剂盒（南京翼飞雪生物科技公司，中国）测定。使用酶标仪（TecanInfinitePro，瑞士）在nm下测量吸光度（OD值），并根据标准曲线计算样品中TNF-α的含量。准确称量肺叶，在95℃的碱液中水解20分钟，然后使用羟脯氨酸检测试剂盒（南京建成生物工程研究所，中国）进行检测。通过UV-VIS分光光度法在nm波长下读取每个样品的光密度。肺羟脯氨酸含量根据制造商的说明书进行定量。2.11肺组织形态学分析将切除的肺样品在4％多聚甲醛固定剂中固定几天，然后包埋在石蜡中。将切片用苏木精-曙红（H＆E）或Masson三色染色，使用OlympusBX53显微镜（日本Olympus公司）检查了肺部的一般形态和胶原蛋白沉积。2.12统计分析数值表示为平均值±标准偏差。使用GraphPadPrism8.0软件中的单向ANOVA分析所有实验结果。使用Student’st检验进行分析，P0.05表示具有统计学意义。3.结果与分析3.1相溶解度研究从图2A可以看出，在0-14mmol/L的HP-β-CD浓度范围内，TET的表观溶解度随着HP-β-CD浓度的增加而线性增加，符合Higuchi和Connors中分类的AL类型。结果表明，TET和HP-β-CD以摩尔比为1：1的化学计量形成络合物。通过线性回归分析，稳定常数（KS）等于83.12M-1。其吉布斯能量的值为-11.14KJ·mol-1，表明该络合过程是自发的。3.2FT-IR，PXRD和DSC3.2.1FT-IR光谱研究FT-IR用于评估宿主-客体复合物中，环糊精的亲脂性腔与药物之间的疏水相互作用。如图2B所示，物理混合物光谱显然仅是纯TET和HP-β-CD光谱的叠加。TET谱图中Ar-H的.09cm-1峰，C-H（CH3）的.56cm-1峰和C-O-C拉伸振动的.88cm-1峰在复合物形成后消失，但在物理混合物中仍可识别到这些特征峰。对于芳香环中的C=C拉伸振动，纯TET在.48、.74、.17和.73cm-1处显示出特征吸收带。而络合物使这些振动显著减弱，甚至检测不到.48cm-1处的峰。这些结果表明，在包合配合物形成时，TET的甲氧基和芳香环已经部分地被包埋在HP-β-CD的非极性腔中。3.2.2X射线衍射研究通过XRD分析研究了纯TET，HP-β-CD，TET-HP-β-CD包合物和物理混合物的晶体结构。如图2C所示。TET结晶粉末显示出几个尖峰，并且其特征峰出现在8.64°，11.76°，13.78°，14.46°，15.70°，19.88°，21.86°，23.10°和27.52°处。相比之下，纯HP-β-CD因其无定形性质而显示出低强度的宽散峰。两个样品物理混合的衍射图显示出晶体TET和无定形HP-β-CD特征峰的简单叠加。同时，物理混合物中TET的衍射峰强度减弱，可能是由于粉末含量稀释造成的。在TET-HP-β-CD包合物的衍射图中未检测到TET的特征峰，而是观察到与HP-β-CD的衍射图相似的曲线，TET衍射特征峰的消失表明形成了络合物。3.2.3热力学分析TET，HP-β-CD，TET-HP-β-CD包合物和物理混合物的吸热峰如图2D所示。类似于TET，物理混合物在°C时出现吸热峰。包合物的形成会影响反应物的熔点和其他性质，从TET-HP-β-CD包合物的DSC曲线可以看出，TET本身或与HP-β-CD之间存在一些相互作用，导致该组合物仅显示出一个弱峰，并在移至较低温度处。Figure2.Phasesolubilitydiagram(A)oftheTET-HP-β-CDsystemat30℃.TheHP-β-CDconcentrationincreasedintherangeof0-14mmol/L.Fouriertransforminfraredspectroscopy(B),powderX-raydiffractionpatterns(C),differentialscanningcalorimeterthermogram(D)ofpureTET,HP-β-CD,driedinclusion